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        1. 细胞培养液详解!

          2021-08-12 10:39


                   现代生物技术均通过细胞作为载体来进行,无论是基因治疗、干细胞、克隆技术都在细胞内进行的。细胞的生长需要一定的营养环境,用于维持细胞生长的营养基质称为培养基,即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质,就其本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境, 使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基其组成成分主要有:氨基酸、 水、 维生素、 碳水化合物、 无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。随着动物细胞大规模培养技术的迅速发展, 作为细胞培养领域中最基本的原料- 细胞培养基的用量也迅速增加, 被广泛应用于细胞生物学科和医学研究的各个领域,如疫苗生产(人用疫苗如乙脑、狂犬、甲肝、乙肝、出血热、麻疹等,兽用疫苗如口蹄、马立克、伪狂犬等) ,基因药物生产(如 EPO、TPA 等) ,临床用单抗(如抗人肝癌单抗、抗人肺单抗、WT3)等。     

          水与平衡盐溶液
                  细胞的生长需要一定的营养环境,用于维持细胞生长的营养基质成为培养基。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基其组成成分主要有:水、氨基酸、维生素、碳水化合物 、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。
                  培养用水:体外培养的细胞对水质特别敏感,对水的纯度要求较高。培养用水 中如果含有一些杂质,即使含量极微,有时也会影响细胞的存活和生长,甚至导 致细胞死亡。用金属蒸馏器制备的蒸馏水,可能会含有某些金属离子,一般不作 为培养用水。配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水 净化装置制备的超纯水。最好用龙头瓶贮存,存放时间一般不应超过2周。

           缓冲溶液、生理盐水、平衡盐溶液

          细胞培养基的基本要求
                 
                 体外培养的细胞直接生活在培养基中,因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH等诸多方面的要求。
          一、营养成分
                 维持细胞生长的营养条件一般包括以下几个方面:

          1、氨基酸:
                是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必须氨基酸:缬氨 酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸。此外还需要谷氨酰胺,它在细胞代谢过程中有重要作用,所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的来源,同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物质。体外培养的各种培养基内都含有必需氨基酸。

          2、单糖:
               培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解,六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高, 半乳糖最低。体外培养动物细胞时, 几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。              

          3、维生素:
               主要扮演辅酶、辅基的角色,必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素 B12 都是培养基常有的成分。

          4、无机离子与微量元素:
                细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素, 还需要微量元素,如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。   

          二、促生长因子及激素
                 各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态(分化或未分化)具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞生长有促生长作用,如胰岛素,它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促进作用,如氢化可的松可促进表皮细胞的生长,泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。

          三、渗透压
                 细胞必须生活在等渗环境中,大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg, 可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在 320mOsm/kg 左右。对于大多数哺乳动物细胞, 渗透压在260-320mOsm/kg 的范围都适宜。

          四、pH
                 气体也是细胞生存的必需条件之一,所需气体丰要是氧和二氧化碳。氧参与三羧酸循环,产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。一些细胞在缺氧情况下,借糖酵解也可获取能量,但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时,一般置细胞于95%空气加5%二氧化碳的混合气体环境中培养。二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞所需成分,它主要与维持培养基的pH有直接关系。动物细胞大多数需要轻微的碱性条件,pH值约在7.2~7.4℃在细胞生长过程中,随细胞数量的增多和代谢活动的加强,二氧化碳不断被释放,培养液变酸,PH值发生变化。由于 NaHCO3 容易分解为二氧化碳,很不稳定,致使缓冲系统难以精确地控制。故这一缓冲系统适合密闭培养。HEPES结合碳酸氢钠使用,可提供更有效的缓冲体系,主要是防止pH值迅速变动,但最大缺点是在开放培养或观察时难以维持正常的pH值。造成pH波动主要是代谢产生的CO2,在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸,培养基pH很快下降。为解决这一问题,合成培养基中使用了 NaHCO3-CO2 缓冲系统,并采用开放培养,使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养瓶, 再通过稳定调节温箱中CO2浓度(5%)与培养基中的 NaHCO3,处于平衡状态。

          五、 无毒、 无污染
                 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力, 因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染(如细菌、真菌、支原体、病 毒等) 、无他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染(如抗体、补体) 。对于天然培养基,污染主要来源于取材过程及生物材料本身,应当严格选材,严格操作。对于合成培养基,污染主要来源于配制过程,配制所用的水,器皿应十分洁 净,配制


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